Dr. med. Christine Lehmann, Medizinische Hochschule Hannover

Die Entschlüsselung des menschlichen Genoms ist weit fortgeschritten. Der größte Teil der menschlichen DNA ist vollständig analysiert. Alle Daten sind in Form einer GEN-Bank zugänglich. Der gentechnologische Fortschritt birgt viele Erwartungen über neue Therapiemöglichkeiten in der Bekämpfung von Krankheiten bis hin zur vollständigen Heilung.

1989 war das Jahr, in dem das CF-Gen entdeckt wurde. Bislang sind über 950 Mutationen auf dem CF-Gen identifiziert worden. Neben dem bekannten Einfluß der verschiedenen Mutationen auf die klinische Ausprägung der Mukoviszidose wird angenommen, daß noch weitere Faktoren existieren, die die klinische Heterogenität zwischen den Patienten erklären. So nimmt man an, daß u.a. genetische Veränderungen außerhalb des CFTR-Gens in der Lage sind, das Krankheitsbild und seinen Verlauf zu modifizieren. Zunächst im Mausversuch, später auch beim Menschen wurde dieser Verdacht bestätigt. So scheint ein Gen auf dem Chromosom 19 in der Position q13 für den intestinalen Phenotyp bei CF mitverantwortlich zu sein. Weitere Forschungen wiederum am Mausmodell (congene CF-Mäuse) konzentrieren sich auf Gene außerhalb des CFTR-Locus, die die pulmonale Ausprägung bei der Erkrankung modifizieren könnten. Eine solche Entdeckung steht noch ganz am Beginn, könnte jedoch helfen, ganz neue Therapieansätze zu eröffnen, und wird daher mit Spannung beobachtet.

Es gibt noch eine ganze Reihe von Detailfragen zu klären, bevor die Gentherapie als wirksame Therapie zur Behandlung der Atemwege bei CF einsetzbar ist. Eines der Hauptprobleme bereiteten immer noch die natürlichen Abwehrmechanismen des Körpers, die verhindern, daß die Trägersubstanzen (z.B. Adenoviren) zu den hochdifferenzierten Zellen des Atemepithels gelangen und in diese eindringen. So findet man auf der apikalen (der dem Lumen zugewandten) Seite der Zellen so gut wie keine entsprechenden Rezeptoren, die einen viralen Transport in die Zelle zulassen. So wurde ein Schwerpunkt der Forschungen entweder darauf gerichtet, die Trägersubstanzen zur basolateralen, rezeptorreicheren Seite der Atemwegsepithelzellen gelangen zu lassen, oder die Trägervektoren so umzuzielen, daß sie an vorhandenen Proteinen der apikalen Seite binden und diese als neue" Rezeptoren zum Eintritt in die Zelle nutzen können. Solche umkodierten Adenoviren müssen jedoch als weitere Barriere zunächst bestimmte Bestandteile der Zelloberfläche, der sogenannten Glykokalix überwinden, die eine Permeabilität und ein Vordringen zu den Rezeptoren erschwert. So ist es notwendig, die Zelloberfläche mit bestimmten Enzymen wie Neuramidasen, Trypsin, Keratase oder Leukozytenelastase vorzubehandeln, die zur Zerstörung bzw. Veränderungen der Glykokalix führen. Ein anderer Ansatz ist die Entwicklung von Vektoren geringerer Größe oder mit Eigenschaften, die der Struktur der Glykokalix besser angepaßt sind (z.B. Retroviren, Lentoviren).

Die natürliche mukoziliäre Clearance führt auch zu einer Clearance der eingesetzten Trägersubstanzen, d. h. von der eingesetzten Menge verbleibt nur ein kleiner Teil in den Atemwegen. J. Zabner aus lowa fand heraus, daß bestimmte gelartige Lösungen, in dem die Trägersubstanzen bewahrt sind, so z.B. Thixotropische Lösungen statt PBS den Gentransfer zum Atemwegsepithel effizienter machen.

Nach erfolgter Einschleusung der Genvektoren (z. B. Adenoviren) in die Zielzelle wird eine Immunrekation ausgelöst, mit der Folge, dass "befallene" Zellen zerstört werden. TN-Faktoren induzieren u. a. eine Apoptose der von Viren befallenen Zellen über Bindung an bestimmte Ligaden, die bei Virusbefall vermehrt exprimiert werden. Eine Blockade solcher Liganden durch einen Zusatz spezifischer Rezeptoren (TNF-related apoptosis inducing ligands receptors) wie DR5 könnte zu einem verlängerten Verbleiben der zugeführten genetischen Information in der Zelle des Atemwegsepithel führen (Lin et al, Birmingham, AL, USA), indem einen Apoptose verhindert wird. Harvey et al zeigte, daß ein Gentransfer über Adenoviren sowohl bei CF-Patienten als auch Gesunden zu einem mäßigen systemischen IL6-Anstieg führt, der sicherlich nicht allein für die Elimination der Genträger nach Applikation auf die Atemwege verantwortlich ist.

Ein Einsatz der Gentherapie bei CF zur antientzündlichen Therapie beschrieben Virellen-Lowell et al aus Cleveland, USA. Auf der Grundlage, daß es bei einer Entzündungsreaktion in den Atemwegen von CF-Patienten zu einem massiven Anstieg von IL 8 (proinflammatorisches Cytokin) verbunden mit sehr niedrigen IL10-Spiegeln (antiinflammatorisch) kommt, wurde im Mausmodell eine Gentherapie entwickelt, bei der die eingesetzten Vektoren"rAAV" (recombinant adeno-assoziierte Viren) die Information für IL10-Cytokine entwickelten. Solche rAAV-IL10-Vektoren wurden intratraleal instilliert bei Mäusen mit einem IL10-Mangel. Nach 8 Wochen waren in der BAL etwa 2-fach weniger neutophile Granulozyten vorhanden als bei den unbehandelten Mäusen als Zeichen einer antiinflammatorischer Antwort. Versuche an Pseudomonas infizierten CFTR knock-out Mäusen stehen noch aus.

Griesenbach et al aus London benutzte den neu entwickelten Sendai-Virus als für IL10 (Se-V-IL10). Durch intranasale Instillation oder intramuskuläre Injektion solcher Vektoren konnte bei Mäusen nach 2 Tagen ein erhöhter IL10-Spiegel sowohl lokal als auch im Serum festgestellt werden.

Ein erfolgreicher Gentransfer zu Behandlung der CF wird dadurch limitiert, daß die für die eingesetzten Viren benötigten Rezeptoren nicht an der apikalen Seite der Atemwegsepithelzellen, sondern an der basolateralen Seite lokalisiert oder funktionell aktiv sind. Ein weiterer Weg um zu erreichen, daß auch Rezeptoren der apikalen Seite genutzt werden können, ist die Kombination der bekannten Trägerin (Adenoviren, Lentoviren, Adeno-assoziierte Viren) mit anderen Viren, die an apikalen Rezeptoren ansetzen können, wobei sie mit ihren Glykoproteinen die der eingesetzten Vektoren überdecken.

Verschiedene Modelle wurden inzwischen getestet. Am erfolgreichsten scheint ein Pseudotyp aus der Familie der Filoviren zu sein, dessen "Marburg" Glykoprotein in der Lage ist, über das apikale Zellepithel die Zelle zu infizieren. In Kombination mit einem geeigneten Vektor könnte so ein Transfer der CFTRcDNA zum CF-Peithel auch von der apikalen Seite her möglich werden.

Waltus et al fand heraus, daß im Gegensatz zu adeno-assoziierten Viren vom Typ 2 (AAV2) solche vom Typ 5 in der Lage sind, die Atemwegsepithelzellen von ihrer apikalen Seite zu infizieren. Es wurden bis zu 930 Rezeptoren an einer apikalen Seite gefunden, die mit hoher Affinität AAV5 binden.

Eine weitere Möglichkeit einen virenvermittelten Gentransfer effizienter zu machen, ist die Beeinflussung der interzellulären Permeabilität.

Wie gesagt, befinden sich die für die am meisten eingesetzten Viren zugehörigen Rezeptoren auf der basolateralen Seite der Atemwegsepithelzellen. Da die Viren aber von der apikalen Seite an das Epithel gelangen, wird ein effizienter Gentransfer enorm erschwert. Zwischen den Zellen befinden sich interzelluläre Verbindungen wie tight junctions, adherens junctions, Desmosomen und Gap junctions, die das apikale Kompartement vom basalen trennen. Diese intrazellulären Verbindungen unterliegen in ihrem Aufbau und Erhalt einer Caiciumabhängigkeit.

Durch Bindung von Calcium über Ca⁺Chelate (z.B. EGTA, EDTA) kann der Verbindungskomplex geöffnet werden, die viralen Vektoren gelangen von der apikalen zur basalen Seite und erreichen die dort lokalisierten Rezeptoren und ein Gentransfer in die Zelle kann stattfinden.

Die Verbindung von Vektoren mit EGTA in einer hypotonen Pufferlösung konnte in vitro den Gentransfer via die apikale Oberfläche von menschlichem Atemwegsepithel deutlich erhöhen. In vivo führten Ca-Chelate zu einer Verringerung der transepithelen Spannung, so dass eine Öffnung der interzellulären Verbindungen wohl auch hier stattgefunden hat. Bei Versuchen an Kaninchen konnte durch diese Methode sowohl der durch Retroviren als auch durch Andenoviren vermittelte Gentransport ins Atemwegsepithel erhöht werden.

Funke et al: Sec-Rezeptoren führen zu einem gezielten Gentransport molekularer Verbindungen in die Zelle, in dem eine Endozytose ausgelöst wird. Bevor der Zellkern erreicht wird, zerfällt der molekulare Komplex in seine Einzelteile. Dieser Prozeß ist u. a. temperaturabhängig, da der SEC-Rezeptor ernergieabhängig arbeitet. Die DNA-Komplexe wurden über confokale Mikroskopie bereits 2 Minuten nach Inkubation in Cytoplasmen der Zellen gesehen, nach 5 Minuten war die DNA im Nukleus nachweisbar.

Quelle:Pulmopharm Info Service